La primera iglesia de Santa Ana fue construida alrededor de 1568, conocida en ese entonces como Ermita de Santa Ana. Fue consagrada a Santa Ana; madre de la Virgen María. La ermita era pequeña hecha de mampostería, ubicada en las proximidades del Puente del Rey y sirvió como parroquia del barrio de Malambo.
Al ser destruida la ciudad de Panamá (1671) y reedificada la nueva en 1673, las autoridades ordenaron el traslado de la Ermita a los predios del extramuro de la ciudad.
En las afueras de la nueva ciudad amurallada se construyó, hacia el año 1677, una humilde ermita que sirvió como parroquia de los habitantes del arrabal de Malambo, que se dedicaron al arreo de mulas, a la agricultura, y a otras artes sencillas.
En el año 1751, en vista del estado deteriorado del templo se dio comienzo a la construcción, alrededor de 80 años después del traslado de la ciudad. La obra prosiguió hasta el año 1754, cuando fue suspendida por falta de recursos.
Tres años estuvo paralizada la construcción de la iglesia, hasta 1757, cuando el rico comerciante español Mateo de Izaguirre y Eguren (e Ibarzabal) se hizo cargo de la terminación de la obra, razón por la cual el Rey de España le concedió el título de Conde de Santa Ana. Este ciudadano que vivía a un costado de la plaza de Santa Ana también apoyó con donaciones a la iglesia.
La iglesia fue inaugurada el 20 de enero de 1764, y es un edificio de sólida mampostería. Su interior está dividido por tres naves. Al actual templo, se trasladaron algunos objetos de la antigua ermita como la escalera de caracol y algunos tableros tallados, con los que se revistió la parte exterior del púlpito.
En 1854, un incendio consumió parte del arrabal, incluyendo a la iglesia de Santa Ana y su estructura y el adorno de los altares fueron destruidos por las llamas del techo. Después del siniestro, la iglesia fue restaurada y dotada de retablos y ornamentos.
En el siglo XX se reconstruyó, el interior se modernizó y se construyó una bóveda falsa (actualmente desaparecida). En 1911 se sustituyó el techo de tejas por uno de zinc acanalado.
Fue fundado el 29 de abril de 1915 por el presidente Belisario Porras, como parte de la división de la ciudad en cuatro barrios, junto con San Felipe, Calidonia y El Chorrillo.
La iglesia de Santa Ana fue declarada monumento histórico nacional en el año 1980.